Разработка иммуноферментной тест-системы «ИФА-анти-ВГЕ IgG» для определения иммуноглобулинов класса G к вирусу гепатита Е в сыворотке крови людей

Abstract

Цель. Разработать иммуноферментную тест-систему для полуколичественного определения иммуноглобулинов класса G к вирусу гепатита Е (ВГЕ) в сыворотке крови людей «ИФА-анти-ВГЕ IgG» с высокой чувствительностью и специфичностью. Материалы и методы. База для данной научной работы – УЗ «Городская клиническая инфекционная больница» г. Минска. Качественное определение анти-ВГЕ IgG в пробах сывороток крови людей осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа с применением референсных наборов: «ИФА-анти-HEV IgG» (НПО «Диагностические системы», РФ), «Вектогеп Е IgG» («Вектор-Бест», Новосибирск). При конструировании тест-системы для качественного выявления анти-ВГЕ IgG использовались разборные 96-луночные полистироловые планшеты («Хема», РФ); рекомбинантные антигены – аналоги белка ORF2 145,1 кДа, участок с 404 по 660 а. о. и ORF3 128,4 кДа ВГЕ 3-го генотипа (НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, РФ); конъюгированные с пероксидазой хрена антитела к IgG человека («Биосервис», «Хема», РФ); постпокрывающий раствор (ХОП ИБОХ НАН Беларуси); раствор для разведения сывороток и раствор для разведения конъюгата (ХОП ИБОХ НАН Беларуси). Результаты. Определены оптимальные концентрации для сорбции белков ОRF2 и ОRF3, составляющие 2,5 мг/л и 0,25 мг/л, время инкубации с ТМБ – 15 минут. Установлены высокие показатели аналитической надежности разработанной тест-системы. Диагностическая чувствительность реализуемого с использованием тест-системы теста определения антител к вирусу гепатита Е составила 100%, а диагностическая специфичность – 87,5% (при пороговом значении 0,2 мг/л). Показатель внутрисерийной воспроизводимости составил 94,9%, межсерийной – 91,2%. Заключение. Доказано доминирующее значение рекомбинантного полипептида ORF2 по сравнению с полипептидом ORF3 при создании тест-системы для детекции антител класса G, что объясняется расположением основных иммуногенных эпитопов в структурном ORF2, к которым вырабатываются антитела. Впервые в Республике Беларусь зарегистрирована и выпускается тест-система «ИФА-анти-ВГЕ IgG человека» для определения анамнестических антител класса G к вирусу гепатита Е в сыворотке кров

Purpose. To develop an immunoenzymatic test system for semi-quantitative assay of class G immunoglobulins against hepatitis E virus (HEV) in human blood serum, "ELISA-anti-HEV IgG", with high sensitivity and specificity. Materials and methods. The research work was conducted in the facilities of Minsk City Clinical Infectious Diseases Hospital. The qualitative determination of anti-HEV IgG in human blood serum samples was carried out by indirect enzyme immunoassay using the reference kits ELISA-anti-HEV IgG (NPO Diagnostic Systems, Russian Federation), and Vectohep E-IgG (Vector-Best, Novosibirsk). To design a national test system for anti-HCG IgG qualitative detection, collapsible 96-well polystyrene plates were used (Hema, Russian Federation; recombinant antigens – analogues of the protein ORF2 145.1 kDa, site 404 to 660 a. o. and ORF3 128.4 kDa HCG of the 3rd genotype (Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera, Russian Federation); human IgG antibodies conjugated with horseradish peroxidase (Bioservice, Khema, Russian Federation); post-closing solution (Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of Belarus); and serum dilution solution and conjugate dilution solution (Pilot Production of the Institute of Bioorganic Chemistry National Academy of Sciences of Belarus). Results. The optimal concentrations for ORF2 and ORF3 proteins sorption were determined as 2.5 mg/l and 0.25 mg/l, respectively, with TMB incubation time of 15 minutes. High analytical reliability indicators of the test system designed were obtained. The diagnostic sensitivity of the test system used to detect antibodies against hepatitis E virus was 100%, and the diagnostic specificity was 87.5% (with threshold value of 0.2 mg/l). The intra-assay reproducibility index was 94.9%, and the inter-assay reproducibility index was 91.2%. Conclusion. The prevailing significance of the recombinant ORF2 protein compared to the ORF3 protein was proved when creating a test system for detecting class G antibodies, which could be explained by the physiology of the virus, since ORF2 is a capsid protein containing the main immunogenic epitopes against which the antibodies are produced. For the first time in the Republic of Belarus, an ELISA-anti-HЕV IgG test system is registered and produced to determine class G anamnestic antibodies against hepatitis E virus in human blood serum by enzyme immunoassay, technical specifications No TU BY 100185093.094–2023.