Разработка и оценка эффективности использования в лабораторной практике молекулярно-генетических методов одновременного выявления в биологическом материале Mycoplasma genitalium и маркеров ее резистентности к макролидам

Abstract

Цель. Оценить эффективность использования в лабораторной практике усовершенствованных технологий мультиплексного ПЦР-анализа для одновременного выявления в биологическом материале ДНК M. genitalium и мутаций в гене 23S рРНК, определяющих устойчивость микоплазмы к макролидам. Материалы и методы. 33 образца ДНК Mycoplasma genitalium из города Минска Республики Беларусь исследовались на наличие в генетическом материале маркеров резистентности к макролидам. Тестирование проводилось при помощи двух технологий мультиплексного ПЦР-анализа в режиме реального времени, предназначенных для обнаружения в биологическом материале M. genitalium и мутаций в гене 23S рРНК, связанных с устойчивостью к макролидам. На базе центральной лаборатории (НИИ антимикробной химиотерапии ФГБОУ ВО СГМУ Минздрава России, Смоленск) применялся метод ПЦР в варианте FRET (с резонансным переносом энергии флуоресценции) с последующим исследованием выявленных мутаций методом секвенирования по Сэнгеру. На базе ПЦР-лаборатории ГУ «Республиканский клинический медицинский центр» Управления делами Президента Республики Беларусь применялся метод ПЦР в варианте DPO (с двойным праймингом олигонуклеотида) для выявления ДНК M. genitalium с использованием тест-системы Allplex MG & AziR Assay (Seegene, Южная Корея). Результаты. Тестирование образцов ДНК Mycoplasma genitalium при помощи технологии ПЦР-DPO подтвердило наличие ДНК M. genitalium в 97% образцов. Распространенность мутаций к макролидам составила 21,87%. Мутационный профиль представлен двумя вариантами нуклеотидных замен в гене 23S pPHK M. genitalium: в позициях A2059G 9,38% и A2058G 12,5%. Тестирование образцов ДНК Mycoplasma genitalium с использованием технологии ПЦР-FRET подтвердило наличие ДНК M. genitalium в 78,7% образцов. Распространенность мутаций к макролидам составила 31%. Мутационный профиль представлен двумя вариантами нуклеотидных замен в гене 23S pPHK M. genitalium: в позиции A2059G (15,5%) и A2058G (15,5%). Нуклеотидные замены в позиции 2611 не были выявлены. В 87,5% образцов с констатированными мутациями результаты исследования с использованием ПЦР-FRET и ПЦР-DPO совпадают. Отмечено расхождение по одному варианту нуклеотидной замены в гене 23S pPHK в позиции A2059G. Заключение. Внедрение в алгоритм диагностики микоплазменной инфекции, обусловленной M. genitalium, методов молекулярной диагностики для одновременного выявления в биологическом материале Mycoplasma genitalium и генетических маркеров резистентности к макролидам позволит урегулировать вопросы рационального назначения антибиотикотерапии и элиминации возбудителя.

Purpose. To evaluate the effectiveness of using improved multiplex PCR analysis technologies in laboratory practice for simultaneous detection of M. genitalium DNA and mutations in the 23S rRNA gene that determine mycoplasma resistance to macrolides in biological material. Materials and methods. 33 Mycoplasma genitalium DNA samples from Minsk, Republic of Belarus, were tested for the presence of macrolide resistance markers in their genetic material. The testing was performed using two real-time multiplex PCR assays designed to detect M. genitalium and mutations in the 23S rRNA gene associated with macrolide resistance in biological material. The central laboratory (Research Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk State Medical University, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Smolensk) used the FRET (fluorescence resonance energy transfer) PCR method, followed by testing the identified mutations using Sanger sequencing. The PCR laboratory of the Republican Clinical Medical Center within the Office of the President of the Republic of Belarus applied the DPO (double oligonucleotide priming) PCR method to detect M. genitalium DNA using the Allplex MG&AziR Assay test system (Seegene, South Korea). Results. Testing of Mycoplasma genitalium DNA samples using PCR-DPO technology confirmed the presence of M. genitalium DNA in 97% of samples. The prevalence of macrolide mutations was 21.87%. The mutational profile was represented by two variants of nucleotide substitutions in the 23S rRNA gene of M. genitalium: at positions A2059G and A2058G with 19.38% and 2.5%, respectively. Testing of Mycoplasma genitalium DNA samples using PCR-FRET technology confirmed the presence of M. genitalium DNA in 78.7% of samples. The prevalence of macrolide mutations was 31%. The mutational profile was represented by two variants of nucleotide substitutions in the 23S rRNA gene of M. genitalium: at positions A2059G (15.5%) and A2058G (15.5%). Nucleotide substitutions at position 2611 were not detected. In 87.5% of samples with detected mutations, the results of the study using PCR-FRET and PCR-DPO were consistent. A discrepancy was noted for one variant of nucleotide substitution in the 23S rRNA gene at position A2059G. Conclusion. Implementing molecular diagnostic methods into the algorithm of diagnosing mycoplasma infection caused by M. genitalium for simultaneous detection of Mycoplasma genitalium and genetic markers of macrolide resistance in biological material will resolve the issues of rational administration of antibiotic therapy and elimination of the pathogen.