Клеточный и гуморальный иммунный ответ к компонентам микробиоты у пациентов с болезнью Крона

Abstract

Введение. Иммунопатогенез болезни Крона ассоциируется не только с изменением состава микробиоты, но и с нарушением ее взаимодействия с мукозальной иммунной системой в результате срыва механизмов иммунологической толерантности. Существующие классические методы не позволяют напрямую определять исходную частоту микробиота-реактивных лимфоцитов. В данной статье представлен методологический подход идентификации Т-клеток, реагирующих на флагеллин, олигоманнан или бактериальный липопротеин, которая включает определение поверхностной экспрессии активационного маркера CD154 в сочетании с внутриклеточной продукцией цитокинов CD3+-лимфоцитами и позволяет выделять субпопуляции антиген-специфических клеток у пациентов с болезнью Крона. Цель. Охарактеризовать субпопуляции Т-лимфоцитов, реактивных к компонентам микробиоты, в периферической крови и слизистой оболочке подвздошной кишки и установить их взаимосвязь с продукцией аутоантител у пациентов с болезнью Крона. Материалы и методы. Материалом исследования явились биопсийный материал подвздошной кишки и периферическая кровь 16 пациентов (10 мужчин, 6 женщин) с болезнью Крона в возрасте от 22,5 до 30,5 года (Х 25,0 года). Мукозальные лимфоидные клетки получали путем программной диссоциации тканей кишки. Лимфоидные клетки культивировали в присутствии компонентов микробиоты в течение 12 ч., после чего оценивали количество антиген-специфических Т-клеток методом проточной цитометрии. Статистическую обработку проводили в GraphPad Prism. Результаты. У пациентов с болезнью Крона установлено статистически значимое увеличение количества T1- и T17-клеток в культурах PBLs, стимулированных флагеллином и липопротеином, которые коррелировали с локализацией (R=0,54, p<0,05) и фенотипом (R=0,86, p<0,05) болезни. В культурах IELs пациентов с болезнью Крона регистрировались изменения только среди клеток Т-хелперов 17-го типа в ответ на флагеллин (p<0,05) и олигоманнан (p<0,01) относительно ГС, коррелирующих с циркулирующими флагеллин-специфическими Т1 PBLs (R=0,80, p<0,01). В культурах LPLs наблюдалась противоположная картина, характеризующаяся повышением как спонтанного (p<0,01), так и маннан-специфического (p<0,05) уровня T1-клеток у пациентов с болезнью Крона относительно ГС, зависящего от тяжести фенотипа болезни (R=0,85, p<0,01). Маннан-специфические мукозальные T17 IELs и T1 LPLs обратно пропорционально коррелировали с концентрацией ASCA IgG (R=–0,64 и R=–0,86, p<0,05 соответственно) в сыворотке пациентов и не зависели от продукции ASCA IgA. Заключение. В данном исследовании продемонстрирована идентификация циркулирующих и мукозальных микробиота-специфических Т-клеток, эффекторные реакции которых приводят к основному повреждению ткани, что необходимо учитывать при комплексной диагностике болезни Крона.

Introduction. Crohn’s disease immunopathogenesis is associated not only with changes in microbiota composition, but also with disrupted interaction with the mucosal immune system as a result of the immunological tolerance breakdown. Existing classical methods do not allow a direct determination of microbiota-reactive lymphocytes baseline frequency. The article presents a methodology to identify T cells reacting to flagellin, oligomannan, or bacterial lipoprotein, based on surface expression of the activating marker CD154 in combination with intracellular production of cytokines by CD3+lymphocytes and allows determining antigen-specific cell subsets in patients with Crohn’s disease. Purpose. To characterize T-lymphocytes subsets reactive to microbiota components in peripheral blood and ileum mucosa and to establish their correlation with autoantibodies production in patients with Crohn’s disease. Materials and methods. The study material was intestinal biopsy material from the ileum and peripheral blood of 16 patients (10 men, 6 women) with Crohn’s disease aged from 22.5 to 30.5 years (with average age of 25.0 years). Mucosal lymphoid cells were obtained by programmatic dissociation of intestinal tissues. Lymphoid cells were cultured in the presence of microbiota components for 12 h, after which the number of antigen-specific T cells was estimated by flow cytometry. Statistical processing was performed in GraphPad Prism. Results. A statistically significant increased T1 and T17 cells numbers were detected in PBLs cultures stimulated with flagellin and lipoprotein in patients with Crohn’s disease, which correlated with disease localization (R=0.54, p<0.05) and phenotype (R=0.86, p<0.05). Changes only among T-helper 17 cells in response to flagellin (p<0.05) and oligomannan (p<0.01) were establidhed in IELs cultures of Crohn’s disease patients as compared to CG, correlating with circulating flagellin-specific T1 PBLs (R=0.80, p<0.01). The opposite pattern was observed in LPLs cultures, characterized by increased level in both spontaneous (p<0.01) and mannan-specific (p<0.05) T1 cells in patients with Crohn’s disease relative to CG, depending on disease phenotype (R=0.85, p<0.01). Mannanspecific mucosal T17 IELs and T1 LPLs were inversely correlated with serum level of ASCA IgG (R=–0.64 and R=–0.86, p<0.05, respectively) in Crohn’s disease patients and did not depend on ASCA IgA level. Conclusion. The study demonstrates the identification of circulating and mucosal microbiota-specific T cells, effector responses of which result in the tissue damage, what should be considered in the comprehensive diagnosis of Crohn’s disease