Разработка и оценка иммуноферментной тест-системы для диагностики острого вирусного гепатита Е

Abstract

Резюме Цель исследования. Разработать отечественную иммуноферментную тест-систему для определения иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита Е (ВГЕ) в сыворотке крови людей «ИФА-анти-ВГЕ IgМ» с высокой чувствительностью и специфичностью. Материалы и методы. База для данной научной работы – УЗ «Городская клиническая инфекционная больница» г. Минска. Качественное определение антител класса М в образцах сывороток крови людей осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с применением референсных наборов – «ИФА-АНТИ-HEV-IgМ», Вектогеп Е-IgМ. Для конструирования национальной тест-системы для качественного выявления анти-ВГЕ-IgМ использовались разборные 96-луночные полистироловые планшеты; рекомбинантные антигены – аналоги белка ORF2 и ORF3 ВГЕ 3-го генотипа; конъюгированные с пероксидазой хрена антитела к IgМ человека; постпокрывающий раствор; раствор для разведения сывороток и раствор для разведения конъюгата. Результаты. Определены оптимальные концентрации для сорбции белков ОRF2 и ОRF3, составляющие 2 мкг/мл и 1 мкг/мл соответственно, установлено время инкубации с тетраметилбензидином (ТМБ) – 20 минут. Диагностическая чувствительность тест-системы составила не менее 99 %, диагностическая специфичность – не менее 99 %. Показатель внутрисерийной воспроизводимости составил 92,3 %, межсерийной воспроизводимости – 86,1 %. Разработаны и утверждены технические условия ТУ BY 100185093.093-2023, Инструкция по применению набора реагентов тест-система «ИФА-анти-ВГЕ-IgМ человека» для определения маркеров острого вирусного гепатита Е в сыворотке крови людей методом иммуноферментного анализа. Заключение. Разработана первая отечественная тест-система для определения иммуноглобулинов класса М к ВГЕ в сыворотке крови людей «ИФА-анти-ВГЕ-IgМ» методом непрямого ИФА. Проведены лабораторные и технические испытания экспериментального образца тест-системы, показавшие ее высокую диагностическую чувствительность, специфичность и воспроизводимость. Утверждена нормативно-техническая документация на тест-систему.

Abstract Objective. To develop a national high-sensitivity and marked specifity enzyme immunoassay test system for determining class М immunoglobulins to the hepatitis E virus (HEV) in human blood serum “ELISA-anti-HEV IgМ“. Materials and methods. The base for this research is City Clinical Hospital of Infectious Diseases in Minsk. Qualitative determination of anti-HEV IgМ in human blood serum samples was carried out by indirect enzyme immunoassay using reference kits – “ELISA-ANTI-HEV-IgМ“, Vecto hep E-IgМ. 96-well polystyrol strip plates were used to design a national test system for the qualitative detection of anti-HЕV-IgМ; recombinant antigens – analogues of the protein ORF2 and ORF3 HЕV of the genotype 3; antibodies against human IgM conjugated with horseradish peroxidase; post-closing solution; serum dilution solution and conjugate dilution solution. Results. Optimal concentrations for sorption of ORF2 and ORF3 proteins were determined, amounting to 2 mg/ml and 1 mg/ml. The incubation time with TMB is set to 20 minutes. Diagnostic sensitivity of the test system was no less than 99%, and diagnostic specificity was no less than 99%. The index of in-series reproducibility was 92,3%, inter-series reproducibility was 86,1%. Technical specifications TU BY 100185093.093-2023 were developed and registered. Direction for use of the reagent kit of the test system “ELISA-anti-HEV-IgM human“ for determining markers of acute viral hepatitis E in human blood serum by enzyme immunoassay was approved. Conclusion. The first national test system “ELISA-anti-HЕV-IgM” for the determination of class M immunoglobulins against hepatitis E virus in human blood serum by indirect enzyme immunoassay was developed. Laboratory and technical tests of the experimental sample of the test system were carried out, shown its high diagnostic sensitivity, specificity and reproducibility. The regulatory, technical and operational documentation for the test system was approved.