Сравнительная характеристика влияния мезенхимальных стромальных клеток, их микровезикул и плазмы, обогащённой растворимыми факторами тромбоцитов, на выжимаемость и апоптоз лимфоцитов селезёнки крыс in vitro

Abstract

АННОТАЦИЯ Одной из важных, но недостаточно изученных характеристик мезенхимальных стромальных клеток (МСК), их микровезикул (МВ МСК) и плазмы, обогащённой растворимыми факторами тромбоцитов (ПОРФТ/PRP), является их трофическая функция, обеспечивающая жизнеспособность клеток-мишеней. Цель исследования – провести анализ способности МСК, МВ МСК, ПОРФТ/PRP оказывать влияние на жизнеспособность, спонтанный и активационный апоптоз культивированных in vitro лимфоцитов селезёнки крыс. Материалы и методы. МСК выделяли из фракции мононуклеарных клеток костного мозга бедренной кости крыс линии Wistar методом адгезии на пластике. МВ МСК получали из кондиционной среды культуры МСК методом центрифугирования при 14 500 g. ПОРФТ/PRP приготавливали путём замораживания/оттаивания концентрата тромбоцитов периферической крови крыс. Лимфоциты селезёнки крыс выделяли на градиенте плотности 1,077 г/см 3 . Выживаемость и степень апоптоза лимфоцитов in vitro оценивали методом проточной цитометрии по включению красителя 7-AAD и связыванию с annexin V. Результаты. Присутствие МСК в концентрациях 10 и 20% вызывало повышение количества живых интактных и ФМА-активированных лимфоцитов (ФМА – форбол-миристат-ацетат) к концу 3-суточного культивирования in vitro. По сравнению с контролем в 8,3–13,5 раза снизилось количество некротических клеток, в 2,3–4,0 раза – количество апоптотических клеток, преимущественно за счёт лимфоцитов, находящихся в стадии позднего апоптоза. МВ МСК в использованных концентрациях не оказывали существенного эффекта на жизнеспособность лимфоцитов, культивированных in vitro, но снижали уровень апоптоза интактных и ФМА-активированных лимфоцитов в 3,6 (р=0,03) и 4,8–5,2 (р=0,048; р=0,03) раза соответственно. Исследования с крысиной ПОРФТ/PRP показали, что в концентрации 1,25% она обладает рост-стимулирующим действием в отношении МСК, но не лимфоцитов, культивированных in vitro. В культуре интактных лимфоцитов ПОРФТ/PRP не оказывала существенного влияния на жизнеспособность клеток при некотором снижении (в 2,7–2,9 раза, p >0,05) количества некротических клеток. В культуре ФМА-активированных лимфоцитов 1,25–2,50% ПОРФТ/PRP обеспечивали повышение количества живых клеток в 1,6–2,2 раза (р=0,002, р=0,01) и снижение числа некротических клеток – в 2,0 раза (р=0,02). Заключение. МСК, МВ МСК и ПОРФТ/PRP вызывают в убывающем порядке повышение жизнеспособности, подавление позднего апоптоза лимфоцитов селезёнки крыс при культивировании in vitro. Лимфоциты, активированные ФМА, более чувствительны к их витальному действию по сравнению с покоящимися клетками.

ABSTRACT Background: The trophic function is one of the important but insufficiently studied features of mesenchymal stromal cells (MSCs), their microvesicles (MVs), and plasma enriched with soluble platelet factors (PRPs), which ensure the viability of target cells. Aim: To analyze the capability of MSCs, MVs, and PRP to affect the viability and spontaneous and activation-induced apoptosis of rat spleen lymphocytes during culturing in vitro. Materials and methods: MSCs were isolated from the mononuclear cell fraction of the femoral bone marrow of Wistar rats using the plastic adhesion method. MVs were obtained from the conditioned medium of MSCs by centrifugation at 14,500 g. PRP was prepared by freezing/thawing rat peripheral blood platelet concentrate. Rat spleen lymphocytes were isolated on a density gradient of 1.077 g/cm 3. The viability and degree of lymphocyte apoptosis in vitro were assessed by flow cytometry for 7-AAD incorporation and binding to annexin V. Results: The presence of MSCs at 10 and 20% concentrations caused an increase in the number of living intact and PMA-activated lymphocytes by the end of 3-day in vitro cultivation. Compared with controls, the amount of necrotic cells decreased 8.3–13.5 times, and the number of apoptotic cells decreased 2.3–4.0 times, mainly due to lymphocytes at the late stage of apoptosis. MVs of MSCs at the indicated concentrations did not significantly affect the viability of lymphocytes cultured in vitro but reduced the level of apoptosis of intact and PMA-activated lymphocytes by 3.6 (р=0.03) and 4.8–5.2 (р=0.048; р=0.03) times respectively. Studies have shown that 1.25% rat PRP has a growth-stimulatory activity against MSCs but not against lymphocytes cultured in vitro. In the culture of intact lymphocytes, PRPs did not significantly affect cell viability with a slight decrease (2.7–2.9 fold, p >0.05) in the number of necrotic cells. In the culture of PMA-activated lymphocytes, 1.25–2.50% PRP increased the number of living cells by 1.6–2.2 times (р=0.002; р=0.01) and the number of necrotic cells by two times (р=0.02). Conclusion: MSCs, MVs of MSCs, and PRP, in decreasing order, enhanced the viability of rat spleen lymphocytes and suppressed late apoptosis during in vitro cultivation. Lymphocytes activated by phorbol myristate acetate are more sensitive to their vital action compared with resting cells.